Como funciona a tecnologia NGS em Oncologia de Precisão – Projeto Tarsila

Como funciona a tecnologia NGS em Oncologia de Precisão

Você sabe o que acontece entre o pedido de um exame genético de uma amostra de tumor e o laudo a ser entregue com o resultado final? Quais etapas são feitas no laboratório que permitem que a sequência genética do tecido tumoral seja determinada para a identificação de eventuais alterações, como trocas de base única (SNVs), inserções ou deleções (indels) no caso de DNA e fusões no caso de RNA? Tudo começa a partir de um bloco de parafina contendo o tecido de interesse, seja material proveniente de uma biópsia ou ressecção cirúrgica. O processo de fixação e inclusão do tecido em parafina preserva a integridade do DNA e do RNA e para que isso ocorra adequadamente é importante que seja garantida a qualidade das soluções utilizadas (por exemplo, o formol tamponado) e respeitado o tempo de incubação recomendado. Depois de emblocado, o material é cortado em um micrótomo e analisado por um patologista para determinação do diagnóstico anatomopatológico e da porcentagem de células tumorais. As lâminas com maior área tumoral são marcadas e a partir delas é que o laboratório fará todo o processamento. O fluxo de trabalho no laboratório pode ser dividido em cinco etapas: 1) extração de ácido nucléico, 2) construção de biblioteca, 3) amplificação clonal ou preparo do template, 4) sequenciamento e 5) análise de dados. 

Na primeira etapa, o processo de extração é realizado utilizando kits comerciais específicos, que geralmente envolvem colunas ou esferas magnéticas recobertas com sílica, que tem afinidade às moléculas de DNA e RNA. Após algumas lavagens, o DNA ou o RNA são eluídos da coluna ou esfera em um volume pequeno. A concentração da solução eluída é determinada com um equipamento de fluorimetria (por exemplo o Qubit) ou espectrofotometria (por exemplo o NanoDrop) e uma massa específica do material é utilizada para a etapa seguinte chamada de construção de biblioteca. Na tecnologia da Thermo Fisher, a quantidade necessária para iniciar a construção de biblioteca é pequena, a partir de somente 10ng de DNA ou RNA. É interessante também que a concentração funcional ou a amplificabilidade do material seja determinada, o que pode ser realizado utilizando ensaios de PCR quantitativo em tempo real (qPCR), comparando com um controle comercial de alta qualidade. 

Para a segunda etapa, imagine que uma biblioteca é uma coleção de moléculas ou fragmentos de DNA, ou cDNA quando o material inicial é o RNA, selecionados de acordo com os alvos de interesse, e de tamanho máximo de até 600 pares de bases. Os alvos são as regiões genômicas específicas que são amplificadas com painéis de iniciadores ou primers. No caso do painel Oncomine Focus Assay (OFA), escolhido para ser utilizado no projeto Tarsila devido a sua ampla aplicação pelos laboratórios parceiros, mais de mil primers amplificam regiões de 52 genes que são conhecidos por sua relevância terapêutica em diversos tipos tumorais, dentre eles o câncer de pulmão. Há também outros painéis mais amplos, como o Oncomine Comprehensive Assay (OCA) Plus, no qual mais de 26 mil primers amplificam regiões de mais de 500 genes, permitindo a análise inclusive de carga mutacional tumoral (TML) e instabilidade de microssatélite (MSI), biomarcadores importantes no contexto de resposta à imunoterapia. Independentemente do tamanho do painel, o princípio da construção de biblioteca é o mesmo. Durante o procedimento, são ligadas às extremidades dos fragmentos sequências de adaptadores que são necessárias para as etapas seguintes de amplificação e sequenciamento. Uma fração desses adaptadores contém os barcodes, que são sequências únicas para cada amostra, o que permite que várias amostras distintas sejam combinadas e sequenciadas de forma conujunta.  

Com a biblioteca pronta e quantificada, segue-se para a terceira etapa que é a etapa de amplificação clonal, ou preparo do template. Antigamente essa etapa era realizada utilizando bactérias, mas atualmente é feita com uma metodologia chamada PCR em emulsão, no caso da tecnologia da Thermo Fisher Scientific. O objetivo da PCR em emulsão é isolar os fragmentos de biblioteca individualmente para que eles possam ser copiados várias milhões de vezes em esferas sólidas, paralelamente. Todo o processo ocorre de maneira automatizada no equipamento Ion Chef. A ligação dos fragmentos de biblioteca às esferas acontece a partir do adaptador. 

E como ocorre a amplificação clonal pela PCR em emulsão? Os componentes da reação consistem nos fragmentos de biblioteca, as esferas e todos os reagentes necessários para a realização da reação em cadeia da polimerase, ou PCR. Além desses componentes, uma solução de óleo é adicionada à reação, permitindo a formação de uma emulsão. Como a fase aquosa não se mistura com a fase oleosa, são formadas micelas, que também chamamos de microrreatores. Dentro de cada microrreator, há somente uma esfera, um fragmento de biblioteca e todos os componentes necessários para a PCR. Ao final da reação, é utilizado um reagente contendo detergente que irá auxiliar na quebra da emulsão, permitindo com que a solução seja composta somente dos fragmentos amplificados, imobilizados ao redor das esferas. O adaptador na extremidade dos fragmentos de biblioteca possui uma molécula de biotina que permite que seja então utilizada uma esfera magnética contendo estreptavidina para captura das esferas amplificadas, num processo chamado enriquecimento. O objetivo do processo de enriquecimento é eliminar as esferas vazias, as quais não houve amplificação dos fragmentos da biblioteca. 

Na quarta etapa, o sequenciamento em si, as esferas amplificadas e enriquecidas são depositadas em chips semicondutores. Cada chip possui milhões de poços, sendo que em cada poço cabe uma única esfera. Cada poço funciona como um micro peagâmetro, pois a química toda do sequenciamento Ion Torrent baseia-se na detecção de íons de hidrogênio. Nucleotídeos são oferecidos automaticamente um por vez, e caso o nucleotídeo oferecido for complementar à base presente no fragmento de biblioteca, a enzima DNA polimerase incorporará esse nucleotídeo à cadeia, e consequentemente um íon hidrogênio será liberado, alterando assim, o pH da solução. O chip detecta essa alteração do pH do meio e converte em voltagem, que posteriormente é convertida em chamada de bases. Por não envolver a utilização de bases modificadas fluorescentes, detecção a laser ou utilização de cascatas de amplificação enzimática, o processo de sequenciamento pela tecnologia Ion Torrent é simples, rápido e altamente escalonável. No sequenciador Ion GeneStudio S5, por exemplo, há disponível 5 modelos de chips diferentes, que possibilitam a geração de até 130 milhões de fragmentos em uma única corrida de sequenciamento. O que muda entre os chips é a quantidade de poços, permitindo que o laboratório escolha o chip apropriado de acordo com a demanda do número de amostras a serem sequenciadas. 

Por fim a quinta e última etapa do processo é a análise de dados, onde as alterações nas bases sequenciadas serão identificadas, anotadas, e traduzidas em um relatório clínico que o médico receberá para fácil interpretação.

Autores: Roberto Ribeiro, Maria Amorim e Mariana Oliveira